脊髓（suǐ）性肌萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种常染（rǎn）色体隐性遗传（chuán）病，居儿童致死性常染（rǎn）色体隐性（xìng）遗传病的第2位。位于染（rǎn）色体5q11.2～q13.3上的运动神经元（yuán）存（cún）活基因（Survivalmotorneuron，SMN）是（shì）SMA的主要致病（bìng）基因。

　　人基因（yīn）组有两个紧邻的高度同源的SMN基（jī）因：端粒侧的SMN1和（hé）着（zhe）丝（sī）粒侧的SMN2，两者仅（jǐn）有5个碱基不同。SMN1是主要功（gōng）能基因（yīn），该基因突变可导致SMA发病，SMN2为临床（chuáng）表型的调节基因（yīn），影响病情（qíng）的严（yán）重程度，其拷贝（bèi）数（shù）增（zēng）加可（kě）减轻SMA表型。目前已知（zhī）约94％的SMA患者为SMN1基因第7和（或）第8外显子纯（chún）合缺失所（suǒ）致，少数（shù）病例可由SMN1基（jī）因（yīn）点（diǎn）突变或小的缺失引（yǐn）起。

　　SMN1基因外显子缺失检测（cè）的意义

　　SMA在（zài）人（rén）群中的发病率为（wéi）1/5000～1/10000，群体携（xié）带（dài）者频率为1/35～1/50，是出生缺陷的高危因素，因此极有必要进行SMA携带者的人群筛查，并通过产前诊断技术（shù）降低人群中SMA患（huàn）儿的出（chū）生率。

　　临床上（shàng）将SMA分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型（xíng），即婴儿型、中间型和少年型，严重程度依次递减。神经专（zhuān）科（kē）医（yī）生（shēng）一（yī）般根据患者发病年龄、临床表现及病情进（jìn）展程度进（jìn）行临床诊断，辅（fǔ）助检查方法包括肌电图（tú）、肌酶（méi）和肌肉（ròu）活检（jiǎn），结合（hé）家族史和SMN1基因分析可（kě）进行确诊。由于SMA患（huàn）儿中约94%为SMN1基（jī）因外显子纯合缺失（shī），因此，SMN1基因缺失检测（cè）对（duì）于SMA的诊断具有更高的灵敏度（dù）和特异性。且对不同型的SMA患者，SMN1纯合缺失率没有显著差异，所以，SMN1纯合缺失的检（jiǎn）测对于不（bú）同型SMA患者具有（yǒu）相同的临床诊断（duàn）价值。在欧（ōu）美人群中，SMN1基因（yīn）纯合缺（quē）失检（jiǎn）测已成为（wéi）诊断和排（pái）除诊断SMA的首选方法。

　　SMN1基因缺失检（jiǎn）测试剂的现（xiàn）状

　　目前，SMN1基因外显子（zǐ）缺（quē）失检测试剂（jì）较为缺乏，临床检验实验室（shì）较（jiào）为公（gōng）认的方法是PCR结合限制性片段长度（dù）多态性（PCR-RFLP）的方法。但该方（fāng）法操作较（jiào）为繁琐，且重复性差，不（bú）利于标准（zhǔn）化，不（bú）易推广。同时，这种方（fāng）法只能检测出纯（chún）合缺失，无法确认杂（zá）合缺失。

　　荷兰的SMAMLPA检测试剂可对待测（cè）靶序（xù）列进行半定量分析（xī），因此既可检测纯合（hé）缺（quē）失，亦（yì）可确认杂合缺失。在国（guó）内（nèi）外（wài）已有多篇文（wén）献（xiàn）报道采（cǎi）用该方法进行SMA患（huàn）者诊断和SMA携带（dài）者筛查。但该（gāi）产（chǎn）品目前仍为“仅用于研究”的试剂，尚未按照体外诊断（duàn）类（lèi）医疗器械上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原国家食品药品监管总局批准了（le）第一项（xiàng）SMN1缺失突变检（jiǎn）测试剂上（shàng）市。该产品采用多重实时（shí）荧光MGB-TaqMan探针PCR法（fǎ），以（yǐ）人（rén）基（jī）因组单拷贝（bèi）基因RPP40为内参基（jī）因，对SMN1基因第7外显子和第8外显子拷贝数进行相（xiàng）对定量检测，用于SMA患（huàn）者的体外辅助分子诊断。SMN1基因外显子缺（quē）失检（jiǎn）测的难点（diǎn）之一在于排除高同（tóng）源（yuán）性（xìng）基因SMN2的干扰，特别是对于（yú）SMN2高拷贝数的受试者，需保证（zhèng）结（jié）果的（de）准确可靠。该产品通过对实时荧光PCR相对定量（liàng）、绝对（duì）定量（liàng）技术进行（háng）系（xì）统整合，并在反应体系中加入特（tè）定化学组（zǔ）分，以抑制（zhì）PCR引（yǐn）物3’端的胞嘧啶（dìng）（C）与胸腺嘧啶（T）的错（cuò）配，增加PCR扩（kuò）增的特异性，从而有效控制SMN2基因（yīn）非特异性扩增对检测结果的（de）影响，准确（què）检出高（gāo）拷贝数SMN2样（yàng）本中（zhōng）SMN1基因（yīn）第（dì）7和（hé）第8外（wài）显子（zǐ）的缺失（shī）情况。

　　鉴于（yú）国内外尚无任（rèn）何按照体外诊断（duàn）试剂批准上市的SMA分子（zǐ）诊（zhěn）断产品，因此（cǐ）临床试验方（fāng）案中依据（jù）EMQN关于（yú）《SMA分子诊（zhěn）断最（zuì）佳实践指南》，采用了国内外SMA体外辅助分（fèn）子诊（zhěn）断领域公认（rèn）的（de）PCR-RFLP法作为对（duì）照方法。临床试验共（gòng）完成（chéng）1069例（lì），其中（zhōng）正（zhèng）常对照组777例（lì），SMA病例（lì）组292例（lì），统（tǒng）计分析结果（guǒ）显示申报产品与对比方法检测结果的一致性为100%（95%置信区间：99.66%～100%）。此外，9747例正常成年（nián）人大（dà）样本中目标外（wài）显子△△Ct分布范围的调（diào）查亦显示，该产品的纯合突变判断界值设（shè）置合理（lǐ）。

　　该试剂目（mù）前批准（zhǔn）的预期用途仅包含纯（chún）合（hé）缺失的检测，尚（shàng）不能用于杂合缺（quē）失的检测，因此无法用（yòng）于（yú）SMA携（xié）带者的筛查（chá），这是该产品的缺（quē）陷之一（yī）。

　　事实上（shàng），该产品在（zài）设计（jì）上（shàng）已考虑到SMA携带者的检测，其检测（cè）原理是以待测（cè）样本中目标（biāo）外显子荧光信号Ct值与内参基（jī）因荧（yíng）光信号Ct值（zhí）之差（chà）（△Ct_s），与（yǔ）正（zhèng）常（cháng）对照品三个（gè）梯度稀释品中（zhōng）目标外显子（zǐ）荧光信号Ct值和内参基因荧光信号（hào）Ct值（zhí）之差的平均值（△Ct_a）之差，即△△Ct，作为待测样本（běn）中（zhōng）目标外显子拷贝（bèi）数检（jiǎn）测变量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据实时荧光定量（liàng）PCR相对定量的基本（běn）数学原理推导（dǎo）得到（dào）申报产（chǎn）品检测变（biàn）量（liàng）△△Ct的计算公式，依（yī）据（jù）这（zhè）一计算公式可推（tuī）导出纯合缺失、杂合（hé）缺失和野生型的（de）△△Ct理（lǐ）论值（或（huò）范围（wéi））；再结合目标外（wài）显（xiǎn）子（zǐ）与内参基因扩增效率差异以（yǐ）及SMN2不同拷贝数的影响，可对上述△△Ct理（lǐ）论（lùn）值进行（háng）优化。结果（guǒ）显示纯合（hé）缺失、杂合（hé）缺失和（hé）野生型（xíng）的△△Ct值（或范围）之（zhī）间（jiān）可设置合理（lǐ）的判断界值，因此理论上该产品可分（fèn）别（bié）检（jiǎn）测出三种基（jī）因状态。但（dàn）鉴于生产企业对杂合缺失与野（yě）生型之间的判断（duàn）界值研（yán）究尚不透彻，再加上缺乏（fá）可判定杂合缺失的对比方（fāng）法等（děng）其他困难，本次（cì）注册申请的预期用途（tú）仅限于检（jiǎn）测纯合突变，即SMA患（huàn）者辅助诊断。

　　综上，SMN1基因外（wài）显子缺失检测（cè）在SMA疾病诊断和SMA携（xié）带者筛查中具有重（chóng）要的临床（chuáng）价值。然（rán）而（ér）到目前为（wéi）止，受到技术水平的限（xiàn）制，相关的体（tǐ）外诊断试剂比较缺（quē）乏，特别是可用（yòng）于SMA携带者（zhě）筛查的（de）杂合缺失（shī）检测（cè），尚无适合的体（tǐ）外诊断试剂上（shàng）市。（器审（shěn）中心审评六（liù）部  何（hé）静云）

来源：中国医药（yào）报